糖尿病肾病（DN）是糖尿病（DM）的主要并发症，现在尚无诊治性插手规范。石杉碱甲（Hup A）是一种自然生物碱，已露馅出显贵的降血糖和抗炎作用。Hup A对糖尿病肾病的保护作用，其潜在机制仍不明晰。浙江大学胡丽丹团队在Pharmacological Research在线发表题为“Huperzine A targets Apolipoprotein E: A potential therapeutic drug for diabetic nephropathy based on omics analysis”的磋商论文，作家接受STZ勾搭的糖尿病大鼠当作糖尿病肾病模子，并诳骗转录组、代谢组、微生物组和蓄积药理学（NP）的组合分析。检测了Hup A对糖尿病肾病的总效应（即尿卵白、肾脏组织结构），提供了Hup A对糖尿病肾病疗养效应的首份凭据，标明Hup A是注意和疗养糖尿病肾病的潜在药物。
张开剩余90%1. 石杉碱甲减轻糖尿病肾病大鼠肾挫伤
石杉碱甲（Hup A）疗养显贵裁汰大鼠尿卵白含量（图1A-B），肾脏指数理会下落（图1C）。Hup A疗养理会减轻了肾小球和小管的挫伤（图1G）。Hup A处理逆转了nephrin和podocin的下调。通过体外CCK8训导评估了Hup A的细胞毒性作用，标明Hup A也不会显贵影响细胞活力，标明其具有考究的安全性。此外，咱们的不雅察露馅，1μM HupA疗养可裁汰炎症水平。这与咱们早期的磋商驱散一致，讲解了Hup A在大鼠模子中的抗炎作用。
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图1 Hup A对DN大鼠肾脏的影响
2. Hup A疗养对肾脏转录组的影响
为了真切磋商Hup A疗养糖尿病肾病的分子机制，对NC组（阴性对照，饲喂范例日粮），DN组（高脂饮食）和DN + Hup A组（高脂饮食+Hup A疗养）进行转录组测序。如图2A所示，与DN比拟，NC中发现了444个各别基因，其中255个下调，189个上调。与Hup A + DN组比拟，DN组出现了81个各别基因，包括33个下调基因和48个上调基因（图2D）。与Hup A + DN比拟，NC粗野出502个各别基因，包括283个下调基因和219个上调基因。DN组中不雅察到Apoe和Apoc2的显贵上调，况兼在Hup A处理后这种上调显贵裁汰。通过GO分析露馅，NC VS DN主要富集肾脏发育、肾系统发育、肾元发育和脂质代谢进程。DN vs. DN + Hup 比较组，学习缅想和脂质代谢富集，KEGG通路富集露馅，与DN组比拟，NC组糖尿病并发症的PPAR信号通路和AGE-RAGE信号通路丰富。值得详确的是，在NC vs DN和DN vs DN + Hup A的比较中，脂质代谢进程富集，标明Hup A处理对DN大鼠脂质代谢有显贵影响（图2E-F）。
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图2 Hup A对肾脏转录组的影响
3. Hup A疗养对肾脏代谢组的影响
转录组相易样本进行代谢组检测，主因素分析（PCA）分析细则代谢变化。NC组和DN组的样品能明细辞别，而DN + Hup A的分散更接近NC组。教唆Hup A疗养能归附DN大鼠的代谢。NC组和DN组之间的比较露馅36种代谢物各别改换，34种代谢物上调，2种代谢物下调。值得详确的是，鞘氨醇、16(R)-HETE和花生四烯酸（AA）在DN组中显贵上调，而在Hup A处理后，鞘氨醇和16(R)-HETE显贵下调，阐述这些物资可能参与了Hup A疗养DN的机制（图3A）。与KEGG通路数据库进行比较，以细则相干的疾病通路、代谢通路和信号通路。图3B露馅了前25条富集的疾病通路，包括慢性肾功能沉重、慢性肾脏疾病和败北相干代谢物，这标明Hup A在DN中具有保护作用。图3C露馅了前20个富集的代谢阶梯和信号通路，主若是AA代谢、凋一火和PPAR信号通路。因此，Hup A对DN的缓解作用可能与这些阶梯忖度。
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图3 Hup A对肾脏代谢物的影响
4. Hup A疗养对肠说念微生物组的影响
接受16S rRNA测序评估Hup A处理对肠说念菌群的影响。在多个工夫点（第0天，第50天和第100天）蓄积粪便样本，以追踪肠说念微生物群在DN进展进程中的动态变化。Shannon指数越高，标明群落各样性越大。图4A中，Shannon各样性指数在DN组中裁汰，而在DN + Hup A组中增多，这标明Hup A处理促进了微生物群的各样性。图4B露馅，上风菌群（门水平）包括厚壁菌门（Firmicutes）、Verrucomicrobia、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和Desulfobacterota。如图4C所示，Hup A处理使Ruminococcus和Colidexibacter属的品貌增多，在DN组中减少，而使链球菌、Phascolarctobacterium、肠球菌、Blautia和Escherichia-Shigella属的品貌减少，在DN组中增多。构建上风种蓄积来发达不同微生物之间的相互作用（前50个otu），红线示意正相干，绿线示意负相干（图4D）。NC组中，乳酸杆菌的品貌特殊高。比拟之下，葡萄球菌和Phascolarctobacterium的品貌极低。根由的是，葡萄球菌和Phascolarctobacterium与乳酸杆菌呈负相干。在NC组中，Blautia的品貌也极低，但与乳酸菌呈正相干。将16S测序驱散与KEGG和MetaCyc数据库相聚拢进行功能瞻望。图4E露馅了KEGG瞻望的二级功能通路，其中氨基酸、碳水化合物和脂质代谢显贵富集。图4F露馅了MetaCyc瞻望的二级功能通路，其中氨基酸生物合成、脂肪酸和脂质生物合成以及糖酵解的富集显贵。这些驱散标明，Hup A可能通过改换肠说念菌群构成和波及碳水化合物、脂质和氨基酸的重要代谢进程来领会DN保护作用。
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图4 Hup A对肠说念菌群的影响及阶梯分析
5. 微生物组、代谢组和转录组的玄虚分析
为了发达各别基因与代谢物之间的忖度，对代谢组和转录组进行了Spearman相干分析（图5A）。咱们超过关怀Hup A疗养后显贵下调的重要基因（Apoe和Apoc2）与脂质代谢生物记号物（鞘氨醇、16(R)- HETE和AA）之间的相干性。驱散标明，Apoe、Apoc2、AA和鞘氨醇与16(R)-HETE呈显贵正相干。对代谢组和微生物群进行Spearman相干分析，以细则代谢物与微生物群构成（属水平）之间的关系。如图5B所示，AA与葡萄球菌呈显贵正相干。鞘氨醇和16(R)-HETE与肠球菌呈显贵正相干，与链球菌、Phascolarctobacterium、Blautia和Escherichia-Shigella呈显贵正相干，与Ruminococcus和Colidexribacter呈负相干。成立了一种针对鞘氨醇的质谱检测重要。驱散露馅，经Hup A处理后，DN中鞘氨醇含量升高，归附到对照水平（图5C）。
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图5 转录组、代谢组和微生物组的相干性分析
6. 生物医学实际考证
通过qRT-PCR考证了Apoe和Apoc2的mRNA水平，并通过WB考证了糖尿病大鼠肾组织中Apoe的卵白水平，驱散与转录组学数据一致（图6A-B）。此外，Apoe和Apoc2的免疫荧光染色在糖尿病大鼠、db/db小鼠组、糖尿病肾病患者肾小球和肾小管中均线路为高信号（图6C、E、F）。Hup A处理后，大鼠肾组织切片荧光信号减轻（图6C），高糖肾细胞模子中也出现通常的趋势（图6D）。此外，细胞模子中的si-Apoe不错改善高糖引起的炎症现象（图7G）。Hup A不错改善糖尿病大鼠的高甘油三酯血症。要而言之，这些实际数据讲解了Apoe在Hup A对DN的保护作用中的作用。此外，咱们的方向是进一步探索Apoe当作临床疗养靶点的后劲。
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图6 多组学数据的多级考证
7. 临床评估
了解Apoe与DN相干生物记号物的临床相干性关于评估其在临床引申中的适用性以及评估Hup A当作疗养有谋略的可行性至关遑急。为了弥补这一空缺，作家分析了Apoe抒发与DN患者各样临床生物记号物之间的关系。共纳入428例DN患者进行进一步分析（图7A）。这些数据阐述了临床生物记号物与Apoe抒发水平之间的关系。Apoe与血糖驱散目标HbA1c和高卵白尿成正相干。Apoe的抒发与脂质相干的生物记号物，包括TG、HDL-C、LDL-C、胆固醇、ApoAI和ApoB之间存在显贵的正相干（图7C）。
为了磋商Apoe在DN中的作用，咱们使用RNA干扰敲除其抒发。用si-Apoe转染HPC，通过qRT-PCR和WB分析证据其敲低效果（图7E-F）。Apoe敲低导致炎症减少，细胞粘附增多，细胞活性升高（图7G-I）。WB分析露馅，与NC组比拟，si-Apoe组自噬体记号物LC3B II/LC3B I卵白抒发理会裁汰，阐述葡萄糖勾搭了更高的自噬水平，si-Apoe裁汰了自噬水平。另一种源于自噬的记号物 Beclin-1，葡萄糖处理后较低，siApoe处理后较高。此外，由于LC3B I螯合p62聚积体，自噬受损时p62聚积。si-Apoe后足细胞中的p62聚积体升高，一致标明HPC自噬水平裁汰以收敛Apoe（图7J）。
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图7 Apoe与临床生物记号物的相干性及Apoe基因在细胞模子中的作用机制考证
8. 蓄积药理学分析
通过数据库蓄积了89个Hup A的潜在靶点，赢得了1720个DN的潜在靶点错乱后，发现了33个共同靶点，并用于进一步分析。为了进一步探索Hup A与DN靶卵白之间的相互作用，将赢得的33个共同靶点导入STRING数据库，构建包含33个节点和145条边的PPI蓄积。驱散标明，凋一火相干卵白（Bax、Bcl-2和Caspase3）可能是DN的潜在靶点。基于11种算法的蓄积模子拓扑分析进一步证据了上述重要方向。诳骗GO和KEGG阶梯富集分析药物-疾病靶点，探讨Hup A疗养DN的潜在分子机制。GO分析的富集露馅，BP主要包括细胞对化学应激的响应、对氧化应激的响应和对外源刺激的响应。MF主要包括伴侣聚拢、内肽酶活性、卵白酶聚拢和丝氨酸水解酶活性。CC 为内质网管腔、膜微域、膜筏和孔复合物。KEGG通路富集分析，糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞凋一火、鞘脂信号通路和细菌感染富集，教唆了Hup A疗养DN的潜在机制。肾组织中Bcl-2和Bax的卵白水平，这两种卵白在细胞凋一火进程中起遑急作用。DN组细胞凋一火理会高于NC组。Hup A处理在mRNA和卵白水平上裁汰了Bax/Bcl-2的比值，标明Hup A处理通过驱散细胞凋一火来改善。
Hup A减轻了糖尿病肾病大鼠的肾脏挫伤。转录组数据和WB标明，糖尿病肾病的改善主要与Apoe和Apoc2相干。此外，代谢组数据标明，糖尿病肾病勾搭的脂质代谢杂沓被Hup A改换，可能波及鞘氨醇。Hup A还丰富了微生物各样性，并改善了糖尿病肾病勾搭的微生物群失衡。斯皮尔曼相干性分析露馅转录组、代谢组和微生物组之间存在显贵关联。Apoe水平与糖尿病肾病患者的临床生物记号物呈正相干。Si-Apoe也在足细胞中领会保护作用。NP分析也标明Hup A可能通过改换脂质代谢、微生物稳态和凋一火来疗养糖尿病肾病，进一步考证了咱们的发现。
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发布于：湖北省